Mutationen sind die Grundlage eines jeden Pflanzenzüchters die genetische Vielfalt einer Art zu erhöhen und damit neue Eigenschaften zu erzeugen. Lange Zeit war es nur möglich ungezielte Mutationen mittels physikalischer oder chemischer Mutagenese in die Pflanze einzubringen. Mit der Publikation und Etablierung von CRISPR/Cas 9 ist es inzwischen möglich, gezielte Mutationen in nahezu jede Pflanze einzubringen und damit die Information eines Gens zu verändern. Als Voraussetzung benötigt man detaillierte genomische Informationen, entweder der ganzen Pflanze oder des spezifischen Gens.

In der Forschung ist CRISPR/Cas9 im Bereich der funktionellen Genomik inzwischen nicht mehr wegzudenken. Durch den gezielten knockout einzelner Gene kann deren Funktion im pflanzlichen Stoffwechsel und in der pflanzlichen Entwicklung entschlüsselt und beschrieben werden.

Am Beispiel der Erbse soll diese Technologie zur gezielten Inaktivierung der Raffinose-Synthase eingesetzt werden. Die Raffinose-Synthase ist Teil eines Stoffwechselwegs an dessen Ende lösliche Zucker aus der Familie der Raffinose Oligosaccharide (RFO) stehen. Diese Zucker, zu denen nicht nur die Raffinose, sondern auch Stachyose und Verbascose gehören, können von Menschen, als auch anderen Monogastriern durch das Fehlen der α-galactosidase nicht gespalten werden, so dass deren Abbau anaerob durch die Darmflora unter erheblicher Gasbildung erfolgt. Diese Flatulenz wird von einigen Menschen als störend empfunden, in der Tierernährung führt der überproportionale Einsatz von Erbsen zu einer schlechteren Futterverwertung, feuchteren Exkrementen mit einer höheren Anfälligkeit für Fußerkrankungen. Auf der anderen Seite gelten Erbsen, als einheimische Eiweißpflanzen, in der Human- und Tierernährung aufgrund der hohen Proteingehalte und günstigen Aminosäurezusammensetzung als außerordentlich wertvoll.

• Verbesserung der genetischen Merkmale in Erbse und anderen Kulturarten
• Reduktion von antinutritiven Stoffen wie Raffinose Oligosaccharide in Erbse

In der Erbsensorte Greenfeast konnte die Raffinose-Synthase erfolgreich mittels CRISPR/Cas9 mutiert werden. Wie erwartet, erfolgte die Mutation 3-4 Nukleotide vor der protospacer adjacent motif (PAM) Sequenz. Insgesamt konnten fünf Varianten der Mutation nachgewiesen werden. Alle Primärmutanten trugen die Mutation heterozygot. In den nachfolgenden Generationen konnten aufgrund der Mendelschen Segregation Linien selektiert werden, die einerseits eine homozygote Mutation im Raffinose-Synthase-Gen trugen und auf der anderen Seite die Gene für CRISPR/Cas9 verloren hatten. Der Anteil der Zucker aus der Familie der Raffinose Oligosaccharide konnte dadurch in den homozygot mutierten Linien auf ca. 50% gesenkt werden. 

• Dr. Jana Huckauf