Zusammenfassung
Um molekulare Schwarzrostresistenzmarker für die L. perenne-Kartierungspopulation LPSR1001 zu entwickeln, wurde die NGS-Methode „Massive Analysis of cDNA Ends“ (MACE) mit der „Bulked Segregant Analysis“ (BSA) kombiniert. Durch eine Schwarzrostresistenz-Phänotypisierung mit Schwarzrostfeldisolaten unterschiedlicher Herkunft wurden vollständig resistente und hochanfällige Genotypen ausgewählt. Für die Genexpressionsanalysen wurden Bulks aus Blattsegmenten von 20 resistenten bzw. 20 anfälligen Genotypen zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Inokulation gebildet. Die Genexpression von resistenten und anfälligen Bulks wurde verglichen und resistenzspezifische exklusiv und hochdifferentiell exprimierte Transkripte und SNPs in den resistenten Bulks identifiziert. Basierend auf diesen Sequenzen wurden Schwarzrost-Resistenzmarker mit enger Kopplung zum Schwarzrostresistenzlokus-LpPg1 entwickelt, von denen zwei Marker LpPg1 flankieren und ein Marker mit dem Resistenzlokus co-segregierte. Eine „in silico“-Kartierung der resistenzassoziierten Transkripte und Marker unter Verwendung des „perennial ryegrass GenomeZipper“ lokalisierte zahlreiche Transkripte auf Kopplungsgruppe 2 und 7, sowie den co-segregierenden Marker LpETR_18 auf Kopplungsgruppe 2 von L. perenne. Zur Identifikation der LpPg1-vermittelten Abwehrreaktion wurden die inokulierten mit dem nicht-inokulierten Zeitpunkt verglichen. Dabei wurde in den Genexpressionprofilen der resistenten Bulks eine Abwehrreaktion zwischen 4 und 8 hpi identifiziert, die auf der Genexpression von antifungalen Proteinen und Phytoalexinen basiert.
Durch eine Phänotypisierung der Kartierungspopulation LPSR1001 mit Kronenrostfeldisolaten wurden, zusätzlich zur Schwarzrostresistenz LpPg1, zwei Kronenrostresistenzen identifiziert. In der Phänotypisierung wurden zwei Resistenztypen identifiziert, die eine vollständige Resistenz, ohne Sporulation und eine moderate Resistenz mit einer zeitlich verzögerten und verringerten Sporulation zeigten. Für jede Resistenz wurde ein Genotyp sowie der resistente Elter und ein anfälliger Genotyp ausgewählt und die Kronenrostentwicklung fluoreszenzmikroskopisch dokumentiert. 60 hpi wurde im vollständig resistenten Genotyp und dem resistenten Elter eine Autofluoreszenz der mit Haustorienmutterzellen in Kontakt gekommenen Mesophyllzellen dokumentiert. Im moderat resistenten Genotyp wurde eine verzögerte Haustorienmutterzellenbildung nachgewiesen, die in der Literatur als „slow rusting“-Resistenz beschrieben wird. Die Genexpressionsprofile der untersuchten Genotypen zeigen für jede Resistenz spezifische Transkripte, an Hand derer die Resistenzen unterschieden werden können. Im vollständig resistenten Genotyp und im resistenten Elter wurden Transkripte mit Funktion am hypersensitiven Zelltod überexprimiert und bestätigen damit die Beobachtungen der fluoreszenz-mikroskopischen Untersuchungen. Im moderat resistenten und vollständig resistenten Genotyp wurden zahlreiche Transkripte mit Homologie zu antifungalen Proteinen überexprimiert. Die Übereinstimmungen in der resistenzassoziierten Expression zwischen dem vollständig resistenten und dem moderat resistenten Genotyp sowie dem vollständig resistenten Genotyp mit dem resistenten Elter geben Hinweise auf eine Doppelresistenz im vollständig resistenten Genotyp.
Die Phänotypisierungen zur Schwarz- und Kronenrostresistenz in der Kartierungspopulation waren nicht miteinander korreliert. Ein Vergleich der Genexpression der schwarzrostresistenten Bulks mit den kronenrostresistenten Genotypen identifizierte 11 identische Transkripte, die an unspezifischen Abwehrreaktionen beteiligt sind. Dies lässt auf eine getrennte Vererbung der Schwarz- und Kronenrostresistenzen schließen.